Seperti disebutkan sebelumnya, mitokondria berisi dua membran utama. Membran mitokondria luar sepenuhnya mengelilingi membran dalam, dengan ruang antarmembran kecil di antara. Membran luar memiliki banyak pori-pori berbasis protein yang cukup besar untuk memungkinkan lewatnya ion dan molekul besar seperti protein kecil. Sebaliknya, membran dalam jauh lebih permeabilitas terbatas, seperti membran plasma sel.
Membran dalam juga sarat dengan protein yang terlibat dalam transpor elektron dan sintesis ATP. Membran ini mengelilingi matriks mitokondria, di mana siklus asam sitrat menghasilkan elektron yang melakukan perjalanan dari satu kompleks protein ke depan dalam membran dalam. Pada akhir rantai transpor elektron ini, akseptor elektron terakhir adalah oksigen, dan ini akhirnya membentuk air (H20). Pada saat yang sama, rantai transpor elektron menghasilkan ATP. (Ini adalah mengapa proses ini disebut fosforilasi oksidatif.)
Membran luar juga mengandung enzim yang terlibat dalam beragam aktivitas seperti pemanjangan asam lemak, oksidasi epinefrin, dan degradasi triptofan. Enzim ini termasuk monoamine oksidase, NADH-sitokrom c-reduktase yang tidak sensitif terhadap rotenone, kynurenine hidroksilase dan asam lemak Co-A ligase. Gangguan pada membran luar memungkinkan protein dalam ruang intermembran untuk bocor ke dalam cytosol, yang menyebabkan kematian sel tertentu. [44] Membran luar mitokondria dapat berhubungan dengan membran retikulum endoplasma (ER), dalam suatu struktur yang disebut MAM (membran ER terkait mitokondria). Ini penting dalam pensinyalan kalsium ER-mitokondria dan terlibat dalam transfer lipid antara ER dan mitokondria. [45] Di luar membran luar ada partikel kecil (diameter: 60Å) bernama sub-unit Parson.
Ruang intermembran mitokondria adalah ruang antara membran luar dan membran dalam. Ia juga dikenal sebagai ruang perimitochondrial. Karena membran luar mudah ditembus oleh molekul kecil, konsentrasi molekul kecil, seperti ion dan gula, di ruang antarmembran sama dengan di sitosol. Namun, protein besar harus memiliki urutan pensinyalan spesifik untuk diangkut melintasi membran luar, sehingga komposisi protein ruang ini berbeda dari komposisi protein sitosol. Salah satu protein yang terlokalisasi ke ruang intermembran dengan cara ini adalah sitokrom c.
