Pada semua spesies, pembentukan oksaloasetat dari piruvat dan intermediet siklus TCA terbatas pada mitokondria, sedangkan enzim yang mengubah PEP menjadi glukosa ditemukan dalam sitosol. Lokasi enzim yang menghubungkan kedua bagian glukoneogenesis ini dengan mengubah oksaloasetat menjadi PEP, karboksibase PEP, bervariasi menurut spesies: dapat ditemukan seluruhnya dalam mitokondria, seluruhnya dalam sitosol, atau tersebar secara merata di antara keduanya, sebagaimana adanya pada manusia.
Transportasi PEP melintasi membran mitokondria dilakukan oleh protein transport khusus; namun tidak ada protein seperti itu untuk oksaloasetat. Oleh karena itu pada spesies yang tidak memiliki PEP intra-mitokondria, oksaloasetat harus dikonversi menjadi malat atau asparat, diekspor dari mitokondria, dan dikonversi kembali menjadi oksaloasetat untuk memungkinkan glukoneogenesis berlanjut.
Glukoneogenesis adalah jalur yang terdiri dari sebelas reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Banyak reaksi adalah langkah reversibel yang ditemukan dalam glikolisis. Dalam kasus di mana laktat adalah sumber, ia diangkut kembali ke hati di mana ia diubah menjadi piruvat, substrat yang ditunjuk pertama jalur glukoneogenik, oleh enzim laktat dehidrogenase. Jalur kemudian dimulai di mitokondria dengan pembentukan oksaloasetat melalui karboksilasi piruvat. Reaksi ini juga membutuhkan satu molekul ATP, dan dikatalisis oleh piruvat karboksilase. Enzim ini dirangsang oleh tingginya kadar asetil-KoA (diproduksi dalam β-oksidasi asam lemak di hati) dan dihambat oleh kadar ADP yang tinggi. Oksaloasetat mitokondial direduksi menjadi malat yang melewati membran mitokondial menuju sitoplasma tempat langkah-langkah glukoneogenesis terjadi.
Oksaloasetat didekarboksilasi dan terfosforilasi untuk menghasilkan fosfoenolpiruvat oleh fosfoenolpiruvat karboksibase. Satu molekul GTP dihidrolisis menjadi PDB selama reaksi ini. Enam langkah selanjutnya di jalur, dikatalisis oleh enzim enolase, fosfogliserat mutase, kinase fosfogliserat, gliseraldehida 3-fosfat dehidrogenase, triosefosfat isomerase dan aldolase (lihat Gambar), sama seperti glikolisis terbalik. Langkah selanjutnya di mana fruktosa-1,6-bifosfatase mengubah fruktosa-1,6-bifosfat menjadi fruktosa 6-fosfat, adalah langkah yang membatasi laju glukoneogenesis.
Fruktosa-6-fosfat dikonversi menjadi glukosa-6-fosfat oleh enzim glikolitik isomerase glukosfosfat. Reaksi akhir glukoneogenesis, pembentukan glukosa, terjadi pada lumen retikulum endoplasma, di mana glukosa-6-fosfat dihidrolisis oleh glukosa-6-fosfatase untuk menghasilkan glukosa. Glukosa dimasukkan ke dalam sitosol oleh transporter glukosa yang terletak di membran retikulum endoplasma.
