Proses sintesis pra-tRNA oleh RNA polimerase III hanya menciptakan bagian RNA dari molekul adaptor. Asam amino yang sesuai harus ditambahkan kemudian, setelah tRNA diproses dan diekspor ke sitoplasma. Melalui proses tRNA “pengisian,” setiap molekul tRNA dihubungkan dengan asam amino yang benar oleh sekelompok enzim yang disebut Aminoasil tRNA sintetase. Setidaknya satu jenis aminoasil tRNA sintetase ada untuk masing-masing dari 20 asam amino; jumlah yang tepat dari aminoasil tRNA sintetase bervariasi berdasarkan spesies. Enzim-enzim ini pertama mengikat dan menghidrolisis ATP untuk mengkatalisasi ikatan berenergi tinggi antara asam amino dan adenosin monofosfat (AMP); molekul pirofosfat dikeluarkan dalam reaksi ini. Asam amino aktif kemudian ditransfer ke tRNA, dan AMP dilepaskan.